【關鍵字】創傷 繼發性腦損傷 細胞培養 損傷模型

摘　要　

中樞神經系統創傷體外模型因其能夠精確控制細胞外環境，觀察創傷后某種特定細胞的病理生理變化，實時監測損傷時細胞生物力學參數的改變，在近年來倍受重視。本文就目前體外創傷模型的種類及有關研究進展進行綜述。

中樞神經系統(CNS)創傷體外模型能消除在體時缺血和炎癥等各種復雜因素的影響，觀察某種特定細胞的病理生理變化，實時監測損傷時細胞生物力學參數的改變，提供一些在體研究不能得到的信息，因此近年來倍受關注。

1、CNS體外創傷模型的種類、生物力學機制和評價

近年來基于CNS創傷性損傷機制，已經開發了許多模型用于研究離斷、擠壓、加速、牽張和剪應力的作用。

1.1 離斷損傷體外模型

軸索離斷是彌漫性軸索損傷和脊髓橫斷傷的重要病理表現。為此研究者建立了兩種體外離斷損傷模型。

Gross等(1983)首先用激光進行單細胞突起離斷，可在距細胞體特定范圍內切斷某一突起或數個突起。這種模型可提供精確的參數，可用作脊髓橫斷損傷的體外研究模型。另外一種離斷損傷模型是培養細胞機械劃痕損傷。Tecoma(1989)首次采用這種模型研究神經元體外創傷性損傷。Muhkin等^①改進了這種模型，他們用電動的轉子進行劃痕損傷，由轉子上的針頭數量來控制損傷的程度和范圍，具有致傷條件統一，更簡便快捷的特點。這種模型操作簡單，費用較低。也是可用來研究繼發性腦損傷級聯反應的體外模型。離斷性損傷的缺點是不能獲得力學參數，如應變力的大小及應變率等。

1.2 壓迫損傷體外模型

壓迫性損傷在脊髓損傷中十分常見，為了在體外模擬壓迫創傷，Ballentine(1988)用自由落體損傷體外培養的脊髓片來復制脊髓的壓迫性損傷。這種模型不能測量撞擊的應變力和應變率，得不到組織損傷的生物力學參數。

另一種是氣壓和液壓損傷模型，可以精確地測定生物力學參數。Shepard(1991)用20ms以下6atm的短暫壓力作用于一個密閉的充滿液體的裝置，使放入裝置內的培養細胞損傷。Wallis(1995)等用1kg的重錘從61cm高落體作用于密封的充滿液體的小室，使小室內的細胞受到傳遞的壓力損傷。Murphy(1993)使培養細胞承受15atm、10分鐘，使細胞產生損傷。然而在體損傷承受的壓力遠比體外實驗的壓力低，長時間持續壓力也與臨床脊髓損傷機制相差甚遠。同時由于損傷裝置的不可壓縮性，與在體損傷的發生機制明顯不同。因此，此類模型未得到廣泛的推廣應用。

1.3 加速損傷模型

閉合性顱腦損傷主要是由于頭顱的加速和減速運動產生的腦內負載在腦實質中形成剪應變所致。

Lucas(1991)用撞擊振動產生200g加速度作用于培養細胞，由切應力造成細胞損害。這種模型的缺點是細胞對加速的反應變化不能測定。Laplaca^②改進了此模型。這個裝置由兩塊平行的粘度計板組成，細胞生長在其中的一塊板上，這兩塊板浸入培養基中，使其旋轉產生的水動力使細胞致傷，力的大小由旋轉速度和兩板間距離控制。致傷時可在顯微鏡下由高速攝影觀察細胞的變化。通過應用粘附的微珠，能夠計算單個細胞承受的應力。但這種流體壓力的改變與在體創傷的相關性目前尚不清楚。

1.4 牽張損傷模型

根據生物力學研究得到的顱腦創傷發生時的力學參數，近年開發了培養細胞牽張損傷裝置，這種模型已引起廣泛的關注。

Ellis^③等用6孔硅膠膜培養皿，給予一定的正壓使硅膠膜牽張變形，導致培養于硅膠膜上的細胞牽張損傷。Cargill等^④用自制的薄硅膠膜培養皿用真空負壓沖動使之變形也可使細胞損傷。此模型的優點是致傷條件易控制，重復性好，可以測量應變率，可用不同的應變率損傷細胞。這種精確的控制有利于比較細胞對生理或損傷變形的反應，對闡明創傷性腦損傷機制有一定作用。由Morrison^⑤報道的改進裝置用激光位移轉換器直接測量牽張過程中膜的位移，用計算機控制的電磁閥控制損傷時間和波形。國內同期研制的多功能小型生物撞擊機亦具備這種優勢，其計算機控制的電磁閥可精確控制損傷時間和程度。

因為在腦組織創傷性損傷過程中，組織承受的力是應變和切變的綜合作用，牽張損傷模型具備了這個特性，細胞在受到驅動壓力牽張變形過程中不僅有牽張的應力，而且還承受切變的應力。

2、用于體外創傷研究的細胞類型

2.1 組織培養

組織培養是CNS的組織片或組織塊體外直接培養，細胞可維持體內結構的空間排列狀態。可以研究細胞間相互作用、基于細胞三維結構的電生理特性及細胞外信號分子的分布。但其制備技術較為復雜。細胞損傷的實時觀測及細胞應變的測定受腦片厚薄的影響。

2.2 細胞培養

原代培養細胞：由于星形膠質細胞在體外可以分裂，易于純化，使其成為目前體外損傷研究最常用的原代培養細胞之一^③。由于神經元是終末分化細胞，分離純化十分困難，故目前的培養神經元體外損傷研究多是神經元和膠質細胞混合培養^⑥。原代細胞培養的優點是可以對某種特定細胞及細胞間的相互作用進行研究。但體外培養細胞目前仍只能用胎鼠或新生鼠進行，在分離過程中可能造成細胞損傷。

細胞系：細胞系對生長條件要求較低，易于培養，可以凍存和無限傳代。細胞系持續分化的特性表明它們的基因表型和蛋白表達已與正常的細胞顯著不同，因此對于結果的解釋應持慎重態度。

3、損傷程度的評估方法

3.1 形態學檢查

細胞損傷后在相差顯微鏡下可實時觀察細胞損傷的早期變化。在體外損傷中，細胞呈現和在體損傷類似的病理形態學改變^③。用掃描電鏡可以觀察到細胞突起和胞體的斷裂。細胞體外損傷后早期超微結構即發生明顯改變^③。

3.2 損傷細胞的檢測

體外細胞損傷和死亡檢測最簡便的方法是染料拒染法，常用臺盼藍(trypanblue)，此法簡便易行①⑥。Muhkin^①用酶標儀定量檢測臺盼藍的量，使這一方法得以進一步改進。

另外熒光染料碘化丙啶(PI)常被用于鑒定死亡的細胞，但Eliis認為PI可以鑒別損傷的細胞，只要細胞膜完整性破壞，都可以著色，當細胞修復后則又拒染^③。

鑒定細胞損傷通透性增高的最常用的生化方法為培養上清中乳酸脫氫酶(LDH)的測定。LDH測定方法簡便，結果穩定。研究發現LDH結果與臺盼藍結果非常一致，具有顯著相關性^⑥⑦。

3.3 末受損傷細胞的檢測

MTT(噻唑藍)可透過活細胞質膜被氧化成藍紫色結晶，此產物在一定范圍內與細胞數成正比，可用比色法測定活細胞的數量。

微管相關蛋白2(MAP-2)是特異性分布于神經元的胞漿和突起中的細胞骨架蛋白，神經元損傷時免疫組化染色可見MAP-2減少或消失，MAP-2可以反應神經元損傷的程度^⑧⑨。是目前鑒別神經元損傷的特異性方法。

3.4 凋亡細胞的檢測

體外培養神經元損傷也同樣有凋亡現象^⑩。凋亡細胞的檢測方法主要有形態學檢查、DNA片段凝膠電泳、原位TUNEL標記、流式細胞儀檢測等。

3.5 細胞功能變化的檢測

在細胞損傷早期，細胞功能改變可由核轉錄因子c-fos，c-jun，NF-κB等特征性向核內轉位和表達的變化觀測。作者利用核轉錄因子這一特點，簡便地證明了創傷性損傷混合培養大鼠皮層神經元后，培養基內可釋放出神經毒性物質。

4、體外損傷模型在創傷性腦損傷研究中的應用

4.1 研究體外創傷后細胞內離子失衡和細胞電生理特性的改變

Rzigalinski^⑾等人的研究表明體外損傷后90分鐘，星形細胞內鈣的含量就達對照組的2～3倍。研究中發現，低鈣可以保護神經元，但卻增加星形細胞的質膜損傷，而且增加鈣離子進入細胞的藥物A23187，可以保護星形細胞。作者認為這可能是不同的細胞對損傷的反應不同。在其隨后的研究中發現，創傷性牽張損傷引起的鈣離子升高在損傷后3小時到24小時之間恢復正常，但損傷可導致鈣介導的信號轉導產生持續性變化，并認為創傷性腦損傷的病理變化過程，鈣離子介導的信號通路改變可能起重要作用，而不是單純的鈣離子增高^⑿。

培養神經元牽張損傷后與NMDA受體相關的電壓依賴Mg2+的阻斷可以減少NMDA受體活化產生的大離子電流和細胞內Ca2+增高^⒀。腦片培養的體外損傷模型可以復制腦損傷后早期時相點的電生理特性。

4.2 研究體外創傷后生化和細胞因子的改變

Lamb^⒁研究表明，牽張損傷星形細胞后卵磷脂合成增加，和脂代謝有關的酶諸如磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)等酶也升高。體外損傷模型還可以附加缺氧、細胞因子等復合因素的作用，可以更深入地了解創傷的機制。Malhotra^⒂等用劃痕或/并化學損傷9L神經膠質瘤細胞系，導致細胞肥大，膠質纖維酸性蛋白和J1-31抗原免疫組化反應增強，兩種損傷因素具有協同作用。表明星形細胞的活化可能與不同的轉錄機制有關。由于沒有小膠質細胞、神經元和少突膠質細胞的相互作用，以及分離培養時的損傷因素，因而比原代星形細胞培養具有某些優點。

4.3 神經保護藥物及機制的研究

體外創傷模型另一重要應用是篩選各種神經保護藥物，尋找新的治療手段。研究表明，NMDA受體拮抗劑MK801和電壓依賴鈣通道阻滯劑尼莫地平、尼法地平聯合應用對損傷的神經元保護具有協同作用^⑥。NO合酶的抑制劑甲基-L-精氨酸對創傷所致的急性分離海馬腦片的損傷具有保護作用^⒃。白三烯代謝抑制劑對液體叩擊壓力致傷的體外培養海馬腦片具有保護作用，可以恢復海馬的順行和逆行的反應^⒄。

亞低溫對創傷的保護機制研究在體外容易進行，因為在體外可以精確控制細胞外環境的溫度。

4.4 體外創傷分子生物學研究

體外創傷模型的分子生物學研究剛剛起步，研究報道甚少。它不僅可以用來研究創傷發生分子生物學機制，而且是研究創傷基因治療最好的模型之一。Lefrancois等^⒅用反義技術抑制星形細胞GFAP的表達，研究對神經元突起離斷損傷后神經元突起再生的影響，結果顯示在反義GFAP轉染的培養細胞中，在損傷后72小時進入損傷區突起的數目和長度明顯高于末轉染的細胞。由于沒有在體環境的復雜性如炎癥、壞死等情況的干擾，在體外轉染比體內更有效。因此體外創傷模型是篩選新的基因治療措施非常有價值的工具。

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