【摘要】目的:探討基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)對腦血管壁細胞外基質(zhì)(ECM)破壞在顱內(nèi)動脈瘤發(fā)病機制中的作用。方法:對15例顱內(nèi)動脈瘤標本和6例非腦血管病病人的正常腦血管，應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測腦血管壁組織內(nèi)MMP-9mRNA的基因表達水平，并通過電鏡觀察顱內(nèi)動脈瘤病人血管壁細胞及ECM的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:動脈瘤壁組織中MMP-9mRNA的表達是正常腦血管的10.06倍(P<0.01)。電鏡下見動脈瘤壁內(nèi)皮細胞損傷，中層平滑肌細胞數(shù)目明顯減少并呈凋亡狀態(tài)，ECM嚴重破壞;而正常腦血管壁細胞及基質(zhì)纖維清晰可見，結(jié)構(gòu)完整。結(jié)論:顱內(nèi)動脈瘤壁組織中MMP-9的基因表達水平顯著升高，并可能通過破壞ECM和誘導(dǎo)平滑肌凋亡參與顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機制。

【關(guān)鍵詞】顱內(nèi)動脈瘤 明膠酶B 細胞外基質(zhì) 顯微鏡檢查 電子 透射

近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)：動脈瘤壁組織中過度表達的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)通過破壞腦血管壁的細胞外基質(zhì)(ECM)參與顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病。有關(guān)誘發(fā)MMP-9過度表達通路的研究較多[1-3]，但對其破壞ECM超微結(jié)構(gòu)研究的報道甚少。為此，我們對顱內(nèi)動脈瘤標本應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測瘤壁組織內(nèi)MMP-9mRNA的基因表達水平，通過透射電鏡觀察血管壁細胞及ECM超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化，并與正常腦血管進行比較，報道如下。

1、材料與方法

1.1 標本來源 15例顱內(nèi)動脈瘤標本來自四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科近年來經(jīng)開顱手術(shù)，在順利夾閉動脈瘤并保證病人安全的前提下獲取;男3例，女12例;平均年齡55歲(動脈瘤組)。同時取6例非動脈瘤病人的腦血管作為對照組，所有標本均經(jīng)華西醫(yī)院病理科明確診斷。

1.2 實時熒光定量 PCR檢測

1.2.1 主要試劑：總RNA提取試劑(TrizoltotalRNAIsolationReagent，GibcoBRL，USA)、RT-PCR試劑盒(MBI公司，Lithuania)、PCR試劑盒(MBI公司，Lithuania)、Taq酶(MBI公司，Lithuania)、dNTP(MBI公司，Lithuania)、引物根據(jù)NCBIGeneBank中的人MMP-9cDNA序列(NM：004994，gi：4826835)，按照5'端相同、3'端互補的原則，兼顧Tm值、G+C含量等因素進行設(shè)計合成、純化，用無RNase的滅菌雙蒸水溶解為10mmol/L。探針由上海生工生物工程公司合成和檢測。根據(jù)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA原始序列設(shè)計合成GAPDH(NM：002046，gi：7669491)特異的引物與探針，上游引物：5'-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3;下游引物：5'-CCAAAGTTGTCATGGATGACCT-3'。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系和條件：MIX94℃2min變性后，進行熱循環(huán);94℃20s、53℃30s、60℃40s收集熒光，循環(huán)次數(shù)：45次。

1.2.3 總RNA提取和mRNA分離：Trizol法提取標本細胞，總RNA紫外分光光度計分析其純度，并電泳驗證MMP-9條帶。

1.2.4 制作MMP-9基因的標準曲線：按程序進行相應(yīng)模板的PCR反應(yīng)和獲取熒光定量PCR，結(jié)果制作成MMP-9基因的標準曲線。將各待測樣本靶基因的相對Ct值減去內(nèi)對照GAPDH的Ct值，獲得校正后的相對ΔCt值，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對兩組樣本均數(shù)行t檢驗。同時比較動脈瘤組織中MMP-9與正常對照組表達水平的倍比關(guān)系。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察 新鮮標本經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，半薄切片光學(xué)定位，超薄切片6μm，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，行H-600IV型透射電鏡觀察。

2、結(jié)果

2.1 MMP-9mRNA在不同腦血管內(nèi)的表達水平

2.2 電鏡結(jié)果 顱內(nèi)動脈瘤組：內(nèi)皮細胞損傷，可見細胞固縮或空泡變性，中層平滑肌細胞數(shù)目明顯減少，多數(shù)細胞核固縮，染色質(zhì)邊聚，可見凋亡小體，部分線粒體腫脹，正常內(nèi)部結(jié)構(gòu)消失，構(gòu)成細胞骨架的ECM模糊不清，呈無定形的絮狀物質(zhì)，細胞缺失的部位有較多碎片(圖1);而正常對照組腦血管壁基質(zhì)纖維清晰可見，結(jié)構(gòu)完整。

3、討論

顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機制目前尚未完全清楚，通常認為是遺傳學(xué)、異常血流動力學(xué)以及血管壁后天退行性變等多種因素綜合作用的結(jié)果。國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)：基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，尤其是MMP-9與顱內(nèi)動脈瘤的形成關(guān)系極為密切。劉兵等[4]運用免疫組化SP法和實時PCR檢測大鼠血管平滑肌細胞內(nèi)MMP-9表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合應(yīng)用細胞因子IL-1α和血小板源性生長因子-B(PDGF-B)能夠誘導(dǎo)MMP-9表達，降解膠原蛋白;結(jié)合顱內(nèi)動脈瘤病人血管壁上有明顯的炎性細胞浸潤及其分泌的大量細胞因子，因此認為：過量表達的MMP-9參與了顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展乃至破裂。1997年，Kim等[1]研究顱內(nèi)動脈瘤夾閉后手術(shù)切除標本發(fā)現(xiàn)：動脈瘤壁上MMP-9表達明顯升高，而血漿和對照組顳淺動脈壁未見升高。Gaetani等[5]研究發(fā)現(xiàn)：動脈瘤壁局部(而非全部)的MMP活性變化參與了顱內(nèi)動脈瘤的形成和破裂。韓利江等[6]應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測5例腦動脈瘤病人MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MMP-9mRNA在所有顱內(nèi)動脈瘤標本中均有表達，陽性雜交信號密集存在于內(nèi)膜，尤其是內(nèi)彈力層。Sehba等[7]通過研究大鼠頸內(nèi)動脈顱內(nèi)分叉部穿孔誘導(dǎo)的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：微血管內(nèi)MMP-9表達水平在局部升高的同時伴隨Ⅳ型膠原減少或消失。本研究結(jié)果也顯示：顱內(nèi)動脈瘤中MMP-9mRNA表達水平顯著性高于對照組(P<0.01)，說明過度表達的MMP-9可能參與了顱內(nèi)動脈瘤的形成。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族可由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等多種細胞以非酶原形式合成分泌，其主要功能是降解構(gòu)成ECM的膠原蛋白、彈性蛋白和非膠原糖蛋白，其中以MMP-9對ECM的破壞性最強[8]。本研究通過透射電鏡觀察到，動脈瘤血管壁內(nèi)皮細胞呈固縮或空泡變性，內(nèi)彈力板疏松分層或完全消失，血管壁平滑肌細胞大量凋亡，中膜主要由數(shù)量不等的纖維細胞構(gòu)成，纖維細胞之間為大片膠原及無定形的絮狀物質(zhì)，說明過度表達的MMP-9對ECM的破壞使血管壁變薄膨出，可能是顱內(nèi)動脈瘤形成及破裂的重要機制之一。

【參考文獻】

[1] KIM S C,SINGH M, HUANG J,et al.Matrix metalloproteinase-9 in cerebral aneurysms [J]. Neurosurgery,1997, 41(3): 642-647.

[2] CROWE D L, TSANG K J, SHEMIRANI B. Jun N-terminal kinase 1 mediates transcriptional induction of matrix metalloproteinase 9 expression [J]. Neoplasia, 2001, 3(1):27-32.

[3] TAKAGI Y, ISHIKAWA M, NOZAKI K, et al. Increased expression of phosphorylated c-Jun amino-terminal kinase and phosphorylated c-Jun in human cerebral aneurysms: role of the c-Jun amino-terminal kinase/c-Jun pathway in apoptosis of vascular walls [J]. Neurosurgery, 2002, 51(4): 997-1004.

[4] 劉兵, 浦佩玉, 高永中. PDGF-B與IL-1α對大鼠動脈平滑肌細胞MMP表達影響的實驗研究[J].中國臨床神經(jīng)科學(xué),2003,11(4): 363-366.

[5] GAETANI P, RODRIGUEZY BAENA R,TARTARA F, et al.Metalloproteases and intracranial vascular lesions [J]. Neurol Res, 1999, 21(4): 385-390.

[6] 韓利江, 趙繼宗,王碩,等.人腦動脈瘤及其皮層小動脈組織72-和92-KdaⅣ型膠原酶mRNA的原位雜交研究 [J]. 中華神經(jīng)外科雜志, 1999, 15(3): 156-159.

[7] SEHBA F A, MOSTAFA G, KNOPMAN J, et al. Acute alterations in microvascular basal lamina after subarachnoid hemorrhage [J]. J Neurosurg, 2004, 101(4): 633-640.

[8] GALT S W, LINDEMANN S, MEDD D, et al. Differential regulation of matrix metalloproteinase-9 by monocytes adherent to collgen and platelets [J].Circ Res,2001,89(6): 509-516.