【摘要】目的：構建大鼠白細胞介素12(rIL-12)基因真核表達載體質粒，建立rIL-12基因修飾并穩定表達的大鼠膠質瘤9L/rIL-12細胞。方法：用Trizol提取大鼠腹腔巨噬細胞總RNA，RT-PCR方法分別獲取rp40和rp35cDNA，依次克隆入pcDNA3.1(-)/myc-HisA質粒中，以IRES連接雙亞基，構建成雙順反子真核表達載體質粒pcDNA3.1/rIL-12。將構建的重組質粒轉染大鼠膠質瘤9L細胞，G418篩選單克隆細胞株，ELISA法檢測其培養上清rIL-12(p70)蛋白含量，同時抽提細胞RNA，RT-PCR方法檢測rp40、rp35基因在9L/rIL-12細胞中的表達。結果：所得rp40cDNA序列與GeneBankNM022611及AF133197、rp35cDNA序列與GeneBankNM053390及AF177031均一致，構建的質粒經PCR、酶切及測序鑒定正確。質粒轉染9L細胞后，獲得2個rIL-12基因穩定、高效表達的9L/rIL-12單克隆細胞株，其培養上清rIL-12(p70)蛋白含量分別為139.0、162.1pg/ml，RT-PCR結果顯示細胞中rIL-12基因表達呈陽性。結論：成功構建了rIL-12真核表達質粒pcDNA3.1/rIL-12，并建立了9L/rIL-12細胞株，為rIL-12基因修飾的膠質瘤疫苗研究打下了基礎。

【關鍵詞】大鼠 白細胞介素12質粒 神經膠質瘤 9L細胞

免疫療法被視為有前景的膠質瘤治療新模式。利用免疫細胞因子及基因治療可以增強機體抗腫瘤的免疫反應，其中白細胞介素12(IL-12)以其廣泛的生物學效應、強大的抗腫瘤作用，被譽為最有效的抗腫瘤細胞因子之一^①②。

本研究利用脂多糖(LPS)刺激體外培養的大鼠腹腔巨噬細胞，提取細胞RNA，RT-PCR擴增出大鼠IL-12(rIL-12)的rp40及rp35cDNA，將之依次亞克隆至pcDNA3.1(-)/myc-HisA質粒中，并用脊髓灰質炎病毒的內核糖體進入位點(internalribosomeentrysite，IRES)進行連接，構建成rp40及rp35兩亞基的雙順反子真核表達質粒pcDNA3.1/rIL-12，應用該質粒轉染大鼠膠質瘤9L細胞，建立rIL-12基因穩定表達的9L/rIL-12細胞株。

1、材料與方法

1.1  細菌、質粒與細胞大腸桿菌感受態細胞DH-5α為Tiangen產品。pcDNA3.1(-)/myc-HisA/IRES質粒由英國格拉斯哥大學免疫和細菌學室XiaoqingWei博士惠贈。野生型大鼠膠質瘤9L細胞株由美國洛杉磯加州大學神經外科LindaMLiau博士惠贈。

1.2 實驗 動物雄性Wistar大鼠購于南方醫科大學實驗動物中心(粵檢證字2002A041)，5~6周齡，體質量(250±50)g，由廣州軍區廣州總醫院醫學實驗動物中心按清潔級動物飼養。

1.3 主要試劑 LPS為Sigma產品，Trizol、G418、LipofectamineTM2000為Invitrogen產品，各種限制性內切酶、高保真PyrobestTaq酶、T4DNA連接酶為TaKaRa產品，反轉錄試劑盒為Promega產品，凝膠回收試劑盒為U-gene產品，質粒提取試劑盒為Tiangen產品，大鼠IL-12(p70)ELISA試劑盒為Biosource產品，DMEM、胎牛血清(FBS)均為Gibco產品。

1.4 引物設計與合成 參照GeneBank中rIL-12的cDNA序列，利用VectorNTIAdvance10軟件設計rp40和rp35的PCR引物，rp40上游引物5'端加上XhoⅠ(CTCGAG)酶切位點，下游引物5'端加上NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位點，rp35上游及下游引物5'端均加上EcoRⅠ(GAATTC)酶切位點。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因為RT-PCR內參，長度為252bp(表1)。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.5 大鼠腹腔巨噬細胞的制備及IL-12基因的克隆 參照文獻^③提取Wistar大鼠腹腔巨噬細胞，加入10μg/mlLPS培養12～24h，收集細胞，Trizol提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，分別用rp40、rp35引物PCR擴增rp40、rp35基因片段;反應條件：預變性94℃5min，94℃45s、63℃45s、72℃45s循環30次，延伸72℃5min，4℃保持。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，紫外燈下切割目標基因條帶，凝膠回收基因片段。分別以XhoⅠ、NotⅠ雙酶切rp40基因片段，EcoRⅠ單酶切rp35基因片段，酶切產物電泳分離，再次凝膠回收、純化，獲得可以用于亞克隆的兩基因片段。

1.6 重組質粒pcDNA3.1/rIL-12的構建及鑒定 具體方法參照文獻^④，分兩步構建：首先以XhoⅠ、NotⅠ雙酶切載體質粒pcDNA3.1(-)/myc-HisA-IRES，回收線性化的載體片段并與rp40基因片段連接，構建中間質粒pcDNA3.1/rp40-IRES。然后以EcoRⅠ單酶切質粒pcDNA3.1/rp40-IRES，回收線性化的載體片段，再與rp35基因片段連接構建pcDNA3.1/rp40-IRES-rp35(即重組質粒pcDNA3.1/rIL-12)。以重組質粒為模板，PCR鑒定rp40、rp35基因的表達。分別用EcoRⅠ單酶切、XbaⅠ單酶切、XbaⅠ和NotⅠ雙酶切重組質粒，并利用VectorNTIAdvance10軟件預測酶切結果。質粒DNA測序由大連寶生物工程有限公司完成，以測序結果鑒定rp35基因插入方向正確與否。構建的重組質粒經鑒定正確后，大提質粒備用。

1.7 質粒pcDNA3.1/rIL-12轉染9L細胞9L細胞的培養參照文獻^⑤。重組質粒采用脂質體介導方法和電穿孔方法轉染野生型9L細胞。脂質體介導轉染方法按LipofectamineTM2000說明書進行。電穿孔方法按GenepulserXcellTMelectroperationSystem(BioRad產品)操作指南進行，參數為方波、300V、20ms。

1.89 L/rIL-12單克隆細胞株的建立及rIL-12的表達 質粒轉染9L細胞后，G418(終濃度600μg/ml)篩選7～14d，采用有限稀釋法和畫圈法挑取單克隆細胞株培養、擴增、傳代。將篩選的單克隆細胞株各代細胞分別取5×106細胞數，用10ml含G418的DMEM完全培養液定量培養72h，取上清，按Biosource試劑盒說明書，采用ELISA方法檢測rIL-12(p70)濃度;同時用Trizol抽提細胞的總RNA，RT-PCR檢測細胞中rp40、rp35基因的表達。

2、結果

2.1 rIL-12基因克隆及重組質粒構建 經LPS刺激的大鼠腹腔巨噬細胞提取的RNA經RT-PCR擴增出rp40及rp35cDNA片段，大小分別約為1008bp和647bp，酶切純化后依次亞克隆入載體質粒pcDNA3.1(-)/myc-HisA-IRES相應的位點，構建成rp40和rp35兩亞基雙順反子真核表達的重組質粒pcDNA3.1/rIL-12。

2.2 重組質粒鑒定 以重組質粒為模板行PCR擴增，產物電泳顯示rp40和rp35條帶清晰。質粒酶切鑒定，電泳條帶與預測吻合，其中EcoRⅠ單酶切可將插入的rp35基因切下;rp40基因中存在1個XbaⅠ酶切位點，XbaⅠ單酶切質粒出現3條帶;XbaⅠ和NotⅠ雙酶切因緩沖體系不同僅出現2條帶。重組質粒測序結果與GeneBank比對，rp40cDNA序列與NM022611及AF133197、rp35cDNA序列與NM053390及AF177031均一致，rp35基因插入載體質粒方向正確。

2.3 9L/rIL-12細胞的建立及rIL-12基因表達 重組質粒轉染野生型大鼠9L細胞后，共獲得12個9L/rIL-12單克隆細胞株，其中第2、7號單克隆細胞株傳至第5代，以5.0×106細胞數/10ml定量培養72h，ELISA檢測培養上清中rIL-12(p70)蛋白濃度分別為139.0、162.1pg/ml。Trizol抽提2、7號克隆株第5代細胞總RNA，RT-PCR結果顯示rp35和rp40基因表達均為陽性。

3、討論

IL-12最早稱為自然殺傷細胞刺激因子(NKCSF)^⑥或細胞毒淋巴細胞成熟因子(CLMF)^⑦。IL-12具有廣泛的生物學活性，主要有以下功能：①促進T細胞及NK細胞增殖，并通過促進分泌IFNγ而增強其殺傷活性;②促進Th1型細胞免疫反應;③促進多種黏附分子和MHC分子的表達，從而增強腫瘤細胞的免疫原性;④抑制瘤體內新生血管形成，從而抑制腫瘤生長;⑤促進一氧化氮生成，導致腫瘤細胞凋亡;⑥特別具有對抗TGF-β、PGE-2、IL-10、IGF-Ⅰ等膠質瘤分泌的免疫抑制細胞因子作用，從而有助于改善腫瘤局部免疫抑制狀態的微環境。IL-12是最有效的抗腫瘤細胞因子之一，是連接體內天然免疫與特異性免疫的橋梁^①②。

IL-12主要由抗原提呈細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞、B淋巴細胞等以“旁分泌”的形式在局部發揮作用。全身給藥時，不僅腫瘤局部IL-12濃度難以達到抗腫瘤的要求，而且大劑量的反復應用可引起嚴重副反應，在腦瘤治療中可引起嚴重腦水腫。將IL-12基因轉導細胞后再用于體內，通過細胞表達，IL-12以旁分泌的形式在局部發揮作用，副反應小，更符合其在體內作用的生理模式^⑧。

IL-12是由二硫鍵連接兩亞基的異二聚體，兩亞基相對分子質量為35ku和40ku，由位于不同染色體上的基因p35和p40編碼，其中p35亞基決定IL-12的種屬特性，而p40亞基包含與IL-12受體結合的必需基團，且其前端包含促進IL-12分泌至細胞外的信號肽。p40單體或同二聚體可與IL-12競爭結合受體而強烈拮抗IL-12的生物學活性，在轉染哺乳動物細胞時，只有兩亞基在體內等量表達并正確折疊，才能形成有生物學活性的IL-12^⑥⑦。因此，采用其進行基因治療前，必須構建兩亞基等量共表達的載體^⑨。目前國內外學者多采用IRES連接p40和p35的方法構建雙亞基共表達的載體，通過IRES在翻譯過程中的內啟動作用實現同一轉錄水平上的等量表達。

國內已經有成功克隆小鼠IL-12基因的報道^⑩，但大鼠IL-12基因克隆尚未見文獻報告。本研究通過提取大鼠腹腔巨噬細胞總RNA，RT-PCR擴增出rIL-12的rp40及rp35cDNA，將其依次克隆至pcDNA3.1(-)/myc-HisA質粒中，并用IRES連接，構建成同時含rIL-12rp40及rp35兩亞基的雙順反子真核表達質粒pcDNA3.1/rIL-12。將構建的質粒轉染大鼠膠質瘤細胞9L，獲得rIL-12基因穩定表達的9L/rIL-12單克隆細胞株，其培養上清經ELISA檢測，rIL-12(p70)蛋白分泌量達139.0、162.1pg/ml。大鼠IL-12雙順反子真核表達質粒pcDNA3.1/rIL-12的成功構建及9L/rIL-12細胞株的建立，為IL-12基因修飾的大鼠膠質瘤疫苗研究打下了基礎。

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